Danach durchlief Valette fast alle wichtigen Ämter des Ordens. Er übernahm unter anderem den schwierigen Posten des Gouverneurs von Tripolis und dank seiner militärischen Fähigkeiten stieg er 1554 zum Admiral der Ordensflotte auf. 1557 wurde er einstimmig zum Grossmeister des Ordens gewählt und machte sich daran, die Unabhängigkeit des Ordens zu stärken, indem er den spanischen Philipp II. veranlasste, den Johannitern die Zuständigkeit in Lehnsstreitigkeiten zuzubilligen. Beim Vizekönig von Sizilien setzte er durch, dass der Orden künftig nicht mehr um Belehnung nachsuchen musste. Ausserdem erreichte er, dass die Rechte und Privilegien, die bisher für den maltesischen Adel galten, auch auf den Orden übertragen wurden.

Zu seiner schwierigsten Aufgabe wurden die Vorbereitungen zur Abwehr des sich abzeichnenden Türkenangriffs. Dieser begann am 18. Mai 1565 mit einer 40.000 Mann starken Invasionsstreitmacht unter Admiral Piale Pascha und General Mustafa Pascha, welcher später unter dem Titel “Great Siege” in die maltesische Geschichte einging. Dank seines taktisches Geschicks und seine militärische Erfahrung verhinderten er die Eroberung Maltas bis die Türken schliesslich am 8. September 1565 aufgaben.

Nach diesem grandiosen Sieg trug ihm Papst Pius V. die Kardinalswürde an, doch Valette lehnte ab.

Am 28. März 1566 legte er den Grundstein für Maltas zukünftige Hauptstadt Valletta, die nach ihrer Fertigstellung 1571 seinen Namen erhielt. Jean Parisot de la Valette war zu diesem Zeitpunkt bereits tot; er war am 21. August 1568 einem Schlaganfall erlegen. Er wurde in der Ordenskirche von Birgu beigesetzt und später in die St. John's Co-Cathedral von Valletta umgebettet. Auf seinem Grabstein ist zu lesen: „Er war das Schutzschild Europas“.